相襯顯微鏡使用中的幾個問題:
(1)相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’<n或n’>n時得到象的明暗反差正好相反,稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時是無法識別的,隨著δ的增大反差變大,當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時,這個轉(zhuǎn)變值約為0.55λ,用70%標(biāo)準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
(2)暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過程中,某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時,并不是光的損失,而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點,它妨礙了精細結(jié)構(gòu)的觀察,當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應(yīng),指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時,該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。
(3)樣品厚度的影響 當(dāng)進行相差觀察時,樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄,當(dāng)采用較厚的樣品時,樣品的上層是很清楚的,深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。
(4)蓋玻片和載玻片的影響樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片,否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求,當(dāng)有劃痕,厚薄不均或凹凸不平時會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。
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